pegRNA
一、概念界定与分子组成编辑本段
pegRNA（prime editing guide RNA）是引导编辑系统（prime editing）中兼具靶向与编码功能的工程化RNA分子。2019年，Anzalone等在Nature上首次报道了prime editing技术，并定义了pegRNA这一核心组件。从分子架构看，pegRNA是一种在经典单向导RNA（sgRNA）基础上进行3'端延伸改造的嵌合RNA，其分子可划分为相互协同的四个结构域：其一为5'端约20个核苷酸的间隔序列（spacer），负责与基因组靶位点互补配对，决定编辑的序列特异性；其二为sgRNA骨架（scaffold），形成多个茎环结构，与Cas9切口酶（Cas9-H840A）结合并维持核糖核蛋白复合物的稳定；其三为紧接骨架3'端的引物结合位点（primer binding site，PBS），通常为8～17个核苷酸，可与Cas9切口后暴露的靶DNA链3'端游离单链互补配对，为逆转录提供引物；其四为逆转录模板（reverse transcriptase template，RTT），位于PBS下游，编码希望写入基因组的新序列，其长度依据所需插入、缺失或替换的碱基数而定。
pegRNA依次包含间隔序列、sgRNA骨架、逆转录模板和引物结合区，分别承载靶向识别、编辑信息与切口DNA末端配对功能。与sgRNA仅负责引导核酸酶切割不同，pegRNA同时充当“地址标签”与“信息载体”，这是prime editing区别于CRISPR-Cas9常规切割与碱基编辑器的根本特征。
二、作用机制：从切口到精准写入编辑本段
pegRNA介导的引导编辑过程可拆解为以下有序步骤。首先，pegRNA与Cas9-H840A切口酶及工程化逆转录酶（如M-MLV RT的改造版本）组装成三元核糖核蛋白复合物。复合物通过间隔序列与靶DNA的碱基互补配对，在原型间隔序列相邻基序（PAM）上游定位，Cas9-H840A仅在靶链上产生一个单链切口，而非双链断裂。随后，切口产生的3'端游离DNA链与pegRNA的PBS发生互补配对，形成逆转录引物-模板复合体。逆转录酶以pegRNA的RTT为模板，从PBS的3'端起始延伸，将RTT编码的序列直接合成于切口处的DNA链3'端。新合成的3'端序列随后与基因组DNA的另一条链竞争配对，通过细胞内的错配修复与链置换过程，将编辑信息固定于基因组中。根据编辑类型的不同，prime editing可进一步分为PE2、PE3、PE3b等策略：PE3在靶位点对侧引入第二条切口（由普通sgRNA引导），以促进新链优先被保留；PE3b则使用与编辑后序列匹配的切口sgRNA，以降低副产物。此外，PE4/PE5等系统通过共表达错配修复抑制因子（如MLH1dn）进一步提升效率，而双pegRNA（dual pegRNA）策略可同时实现较大片段的插入或删除。
值得注意的是，pegRNA的3'端延伸结构可能形成二级结构或与间隔序列发生分子内配对，从而影响其与Cas9的组装及逆转录效率。因此，pegRNA的理性设计需兼顾PBS长度、RTT长度、切口与编辑位点的相对位置（通常位于PAM上游约3 bp处）、3'端保护性修饰（如添加结构化基序）以及避免RTT与PBS形成稳定二级结构等参数。
三、设计原则与优化策略编辑本段
pegRNA的设计是决定引导编辑效率的关键。PBS长度过短会导致引物配对不稳定，过长则可能引发pegRNA自身折叠或非特异性结合，常用范围为8～15 nt，需通过实验筛选确定最优值。RTT长度需覆盖待写入序列并预留一定同源臂，通常为10～30 nt；对于大片段插入，可采用“flap”策略或双pegRNA切割。间隔序列需避免脱靶，并符合SpCas9或其它Cas变体的PAM要求。近年来，研究者发展了基于深度学习的pegRNA活性预测模型（如DeepPrime、PRIDICT），以及高通量筛选平台（如PRIME-DS、Massively parallel reporter assay），可显著减少实验试错成本。此外，在pegRNA 3'端引入tevopreQ1等稳定化基序，或采用化学修饰核苷酸（如2'-O-甲基、硫代磷酸修饰），可提高pegRNA的胞内稳定性与编辑效率。
四、应用前景与挑战编辑本段
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